流式细胞术的影响因素多种多样，包括来自流式细胞仪的工作状态、临床标本中存在的某些物质（如一些药物的自身荧光对免疫荧光染色的干扰等）、标本处理过程的相关因素、环境因素及人为无意识因素的影响等。流式细胞仪工作状态可以通过日常正确的保养及光路、流路校正等加以保障，人为无意识因素可以通过教育加以杜绝或改进，标本中药物的影响可以通过日积月累的经验总结得以逐步明确。因此，常见的影响因素主要来自荧光染色及与荧光染色间接相关的因素。对荧光染色常见影响因素的了解，有助于我们在临床流式细胞学检验中尽可能避免测量误差和采取有效的修正措施，这对于提高临床流式细胞学检验的质量十分重要。

第一节　温度

环境温度对荧光染色有明显的影响。一般来说，溶液的荧光强度随温度的降低而增强，温度升高与荧光强度的减弱在一定范围内呈线性关系。温度升高，荧光强度减弱的原因主要是溶液的黏度减小，溶剂与溶质分子的动能增加，使得荧光分子的其他分子之间的碰撞概率增加，激发态荧光分子通过分子间碰撞或分子内能量的转移，将自己的能量转移出去。以非荧光发射的形式回到基态，造成荧光猝灭，量子产率（quantum yield）降低。如果溶液中有猝灭剂存在，则猝灭剂的作用也会随温度的升高而增大。为了更加明确地表示温度与荧光减弱之间的关系，人们将温度升高时荧光减弱的百分率定义为温度系数（temperature coefficient，TC）。就一般荧光物质而言，温度系数大约等于1%，但有些荧光物质可大到5%。环境温度在20℃时，一般荧光染料即可出现温度猝灭反应，之后随温度的升高，荧光猝灭反应被加强，甚至造成荧光完全猝灭。环境温度在20℃以下，荧光量子产率无明显变化，基本上保持相对稳定。

因此，针对环境温度对荧光产生的猝灭反应，在进行临床流式细胞学检验的过程中，要求荧光染色及荧光染色后的反应管应在适当低温环境下放置，并尽可能使反应管避光保存。如果条件允许的话，应使环境温度维持在20℃以下并保持恒定，这样就可以将环境温度对荧光染色的影响降低到最低水平，确保流式检验的质量。当然，也可以采用恒温样品架维持样品温度的恒定，达到减少温度对荧光强度的影响的目的。

第二节　酸碱度

如果荧光物质为弱酸或弱碱性，则溶液酸碱度（pH）的改变将对荧光强度产生较大的影响。荧光色素发光的最有利的条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用，尽可能避免分子之间的相互碰撞作用。因此，要使每一种荧光染料的量子产率最高，就需要使荧光染料分子在溶剂中保持与溶剂间的电离平衡。具体到每一种荧光染料，表现出都有自己最合适的pH，如EB的pH在7.2～7.6。如果pH发生改变，可能造成荧光光谱的改变，也可造成荧光强度的降低。一般情况下，荧光素常用pH为8.0。

第三节　荧光染料浓度

在荧光染色过程中，必须确定所用荧光染料的浓度是否与荧光强度有直接的比例关系。当染料浓度较低时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大。当荧光染料达到一定浓度后，如继续增加浓度，不仅不会使荧光信号再有相应的增强，反而会使荧光强度下降。这种因浓度增大会使量子产率减少，荧光染料的浓度与其量子产率之间的这种关系，称为浓度猝灭（concentration quenching）。

在生物物理学中，荧光强度、量子产率和荧光染料浓度之间的关系有等式：F=KφεI0（1−e−εlC），其中F是荧光强度，K是仪器常数，φ是量子产率，I0是激发光强度，ε是克分子消光系数，l是样品池光径，C是荧光染料的浓度。只有当荧光染料的浓度处于很稀的浓度时，F=KI0φ•［1−（1−εlC）］=KI0φεlC。因此，切记荧光染料的浓度过高时，荧光强度反而大大低于接近饱和时的荧光强度。为什么会发生浓度猝灭现象呢？当前能够做出的解释是：当荧光染料处于稀释时，荧光染料分子之间的相互作用几乎完全消失，量子产率最大，荧光强度的发射最强。当溶液浓度增加时，荧光染料分子之间发生碰撞的概率增加，单线能级的激发分子在发出荧光之前很容易与未激发的荧光分子碰撞，形成二聚体或多聚体，使量子产率下降；同时，各能级之间的干扰明显增加，降低了处于激发态电子的稳定性，缩短了电子处于激发态的时间，造成非辐射跃迁的概率增加，也可引起量子产率下降；另外，荧光染料浓度过高时，造成荧光分子在溶剂中的分布不均匀，靠近入射光面的溶液吸收光强，而进入溶液深层时，光吸收越少，发出荧光的分子也越少，出现所谓的内滤光效应（inter filter effect）。

因此，流式细胞术在荧光染色过程中，必须事先确定所用荧光染料的浓度是否与荧光强度有直接的比例关系，以选择最合适的染色浓度。实际工作中，可以通过检查所得到的荧光值来判断所用荧光染料的浓度是该染料浓度-荧光强度曲线达到峰值前的浓度，还是峰值后的浓度，原则上应采用峰值前浓度进行检验。简便的判断方法是：略微减少荧光染料溶液的加入量，若上机测定得到的荧光强度减弱则为峰值前浓度。

第四节　杂质对细胞荧光染色的干扰

杂质对荧光的猝灭作用多因溶剂中含有一些不发光的物质引起，如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁离子、银离子等。这些杂质分子可以与受激发的荧光分子发生相互作用，使受激发处于三重态的荧光分子的振动能量丢失或消耗，造成量子产率减少，引起荧光猝灭。还有的杂质分子作为荧光分子的取代基，改变了电子的自旋状态，使电子从激发态过渡到亚稳态，导致无辐射跃迁，也可以使量子产率降低。还有的杂质不一定和荧光分子结合，而是和荧光分子保持一定距离，两者以电共振方式相互作用，使荧光分子激发能丢失。

第五节　细胞固定剂对细胞荧光染色的干扰

细胞荧光染色技术中，使细胞固定的固定剂对荧光染色也有显著的影响。如DNA测定时使用的荧光染料，有PI、EB、AO等，人们发现某些细胞固定剂对这些荧光染料有明显的影响，如使用戊二醛、甲醛固定的细胞比不固定细胞的荧光强度要弱50%左右，其主要原因是由于醛基分子与细胞内含有氨基的物质结合，干扰了插入性荧光染料与核酸分子的结合，造成荧光发射强度减弱。醇类固定剂虽然也有轻微的荧光猝灭作用，但却是固定剂中对荧光强度影响最小的一种固定剂。因此，在临床流式细胞学检验的实际工作中，细胞固定剂尽量选择醇类，如采用70%的乙醇固定。再结合温度对荧光染色的影响，应使用4℃预冷的70%乙醇进行4℃环境下的低温固定。

第六节　溶液黏度对荧光的影响

荧光强度一般随介质黏度的升高而增强。因为介质黏度增加，减少了分子碰撞，从而减少了能量损失。如荧光物质NTS在不同浓度的蔗糖水溶液中，荧光强度随黏度增加而增加。利用溶液黏度对荧光强度产生影响的常识，在临床流式细胞学检验的实际工作中，应尽量保持荧光染色在一定黏度的背景中进行，标本稀释最好采用含有一定黏度的溶液进行，如含3%牛血清白蛋白的PBS溶液等。

第七节　其他影响因素

流式细胞术分析对象为各种临床标本，除以上几种常见的重要影响因素外，还有许多甚至目前不为人们所知的因素，均可能对检验结果带来或多或少的影响。如血液、骨髓、胸腹水标本采集时使用的抗凝药，人们已经观察到进行淋巴细胞亚群等分析时，采用肝素抗凝的标本保存期较采用EDTA、枸橼酸葡萄糖（ACD）等抗凝的标本保存期长。另外，来自患者的各种标本可能含有某些药物，在激光的照射下发出干扰荧光或者药物本身即具有自身荧光。因此，在日常临床流式检验中应当适当加以注意，及时总结并交流，将各种影响降低到最低限度。（王超　吴丽娟）

参考文献

1. 王书奎，周振英.实用流式细胞术彩色图谱［M］.上海：第二军医大学出版社，2004：89-90.

2. 李明君.肺癌血清自体荧光光谱的测定与分析［J］.郑州大学：中国优秀硕士学位论文数据库，2007：16-20.

本文选自吴丽娟主编《流式细胞术临床应用》

1. 编者队伍权威：编写团队来自成都军区总医院、北大医院、协和医院、复旦大学儿童医院、四川大学华西医院、第三军医大学西南医院等。

2. 内容详尽：从流式检验的基本理论和方法入手，围绕流式细胞仪的基本原理、技术以及其在临床疾病诊断和医学科学研究中的应用，进行了全面、系统、深入浅出的介绍和讨论。

3. 实用性强：参照此书具体检验项目的操作步骤、注意事项、参数设置、临床意义可以进行流式检验常见项目的检测和临床咨询工作；可以了解仪器的保养维护、质量控制、当前国际上的通用规范等。是从事临床科研的必备工具用书。